ibidi3孔/8孔/12孔可移除腔室載玻片可提供了一種簡(jiǎn)單且經(jīng)濟(jì)高效的免疫熒光實(shí)驗(yàn)方案，使用一片可移除的腔室載玻片進(jìn)行細(xì)胞的培養(yǎng)，固定和染色，無(wú)需爬片，是倒置/正置顯微鏡以及長(zhǎng)期樣品儲(chǔ)存的理想選擇。 此次實(shí)驗(yàn)應(yīng)用提供了一種使用ibidi8孔可移除腔室載玻片（80841）培養(yǎng)、固定和染色細(xì)胞的簡(jiǎn)單方案。培養(yǎng)MCF-7細(xì)胞并用福爾馬林溶液固定。細(xì)胞核用DAPI染色，肌動(dòng)蛋白骨架用DYE-490鬼筆肽染色。利用抗體染色，通過(guò)免疫細(xì)胞化學(xué)可以探測(cè)其他細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)。 
實(shí)驗(yàn)使用的材料和試劑： 
· 8孔可移除腔室載玻片（ibidi，80841） · 可移除腔室載玻片用的蓋玻片，24 x 60 mm（ibidi，10811） · 細(xì)胞：MCF-7（CLS，300273） · 細(xì)胞培養(yǎng)基 · 細(xì)胞培養(yǎng)試劑 · PBS緩沖液 · 福爾馬林中性緩沖液，10％（Sigma，HT5011） · 染色試劑 · 封片劑：FluoroshieldTM（Sigma，F(xiàn)6182） 實(shí)驗(yàn)方案： 細(xì)胞培養(yǎng)，固定，染色和成像觀察--都是在一個(gè)開(kāi)放型小室中搞定：） 
步驟1： 須在預(yù)實(shí)驗(yàn)中確定細(xì)胞系的正確接種濃度。根據(jù)您的細(xì)胞類型，用4-6x104細(xì)胞/ ml在2-3天內(nèi)產(chǎn)生匯合的單層。 1.在無(wú)菌條件下，打開(kāi)8孔可移除腔室載玻片（ibidi，80841）包裝?！ ?/p> 2.像往常一樣用胰蛋白酶消化并計(jì)數(shù)細(xì)胞。細(xì)胞濃度為5×104細(xì)胞/ ml MCF-7?！ ?/p> 3. 將400微升細(xì)胞懸浮液加入腔室的每個(gè)孔中。避免搖晃，因?yàn)檫@會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞分布不均勻?！?/p> 4. 用配套的蓋子蓋住。在37°C和5％CO2下培養(yǎng)。細(xì)胞至少培養(yǎng)24小時(shí)，或直到建立的單層?！?/p> 步驟2： 固定是染色程序的第一步操作。目標(biāo)是將細(xì)胞，細(xì)胞形成物或組織維持在其當(dāng)前狀態(tài)，并在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)通過(guò)化學(xué)試劑保存?！ ?/p> 1.小心地吸出細(xì)胞培養(yǎng)基?！ ?/p> 2.用PBS洗兩次?！?/p> 3.加入400μl福爾馬林溶液?！ ?/p> 4.在室溫下孵育30分鐘。 5.小心吸入福爾馬林溶液?！ ?/p> 6.用PBS洗滌三次?！?/p> 步驟3： 應(yīng)根據(jù)感興趣的細(xì)胞結(jié)構(gòu)選擇染色試劑。在該方案中使用DAPI和DYE-490鬼筆環(huán)肽染色MCF-7細(xì)胞的細(xì)胞核和肌動(dòng)蛋白骨架。 1.準(zhǔn)備你的染色溶液： 2.小心吸出PBS。 3.移取400μl染色溶液到每個(gè)孔中 4.在室溫下避光孵育30分鐘 步驟4： 染色后清洗樣本可較大限度地減少背景信號(hào) 1.小心地吸出染色溶液 2.加入400μl緩沖液 3.小心地吸出緩沖液 4.重復(fù)步驟2和步驟3至少一次 步驟5： 從一個(gè)邊緣開(kāi)始，用手或用鑷子小心地取下硅膠墊圈。該步驟應(yīng)以緩慢，穩(wěn)定的進(jìn)行，以避免損壞細(xì)胞層。 
步驟6： 完成染色程序后，須在用顯微鏡成像之前封固樣品。該步驟還可防止樣品脫水?！ ?/p> 1.將載玻片側(cè)面在干凈的實(shí)驗(yàn)室濕巾上輕敲，去除樣品中多余的介質(zhì)。 2.將封固劑涂在樣品上。用24 x 60毫米的蓋玻片覆蓋安裝好的樣品，小心地將蓋玻片放到安裝介質(zhì)上，以避免夾住任何氣泡?！ ?/p> Tip：建議使用硬化封片劑，如FluoroshieldTM (Sigma-Aldrich), Vectashield? (Vector Laboratories Inc.), or ProLong Antifade? (ThermoFisher Scientific)?！?/p> 3.等封片劑固定好。 
步驟7：顯微觀察 
在可移除8孔腔室載玻片中免疫染色的MCF-7細(xì)胞的熒光顯微鏡檢查。綠色：α-微管蛋白，紅色：F-肌動(dòng)蛋白（鬼筆環(huán)肽），藍(lán)色：細(xì)胞核 (DAPI)。使用20倍物鏡拍攝寬場(chǎng)熒光圖像?！ ?/p> 免疫熒光實(shí)驗(yàn)實(shí)例 
人眼的小梁網(wǎng)細(xì)胞，在 ibidi 8 Well Chamber 8孔可移除載玻片中。F-肌動(dòng)蛋白絲顯示為綠色；細(xì)胞核被 DAPI（藍(lán)色）染色。圖片由中國(guó)香港香港理工大學(xué)視光學(xué)院的Samantha Shan提供?！?/p> |
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