ibidi μ-Slide Chemotaxis細胞趨化載玻片對嵌入Matrigel?中的HUVEC（人臍靜脈內皮細胞）進行免疫熒光染色的詳細實驗方案；在趨化性細胞向遷移之后，可通過免疫細胞化學染色研究了定向細胞遷移的形態學特征。 
μ-Slide Chemotaxis 實驗材料準備： 
實驗步驟： 把HUVEC接種在50％Matrigel?中，并填充至μ-Slide Chemotaxis中，然后將其沿10％FCS梯度遷移24小時。采用免疫染色法觀察內皮細胞在Matrigel?中定向遷移后的形態學特征。HUVEC的染色是直接在μ-Slide細胞趨化載玻片中進行的。在染色方案的所有步驟中，將60 μl的相應溶液分別添加到兩個大儲液池中。在孵育過程中，所有塞子均保持關閉狀態，以免干擾通過觀察通道的擴散。除非另有說明，否則所有步驟均在室溫下進行。 
實驗操作流程： 1) 從一邊儲液池中取出塞子，然后吸出培養基。在抽吸和沖洗步驟中，將塞子留在通道中。 2) 用1x PBS洗滌→3x 10分鐘 3) 用4％多聚甲醛固定細胞和基質蛋白→1x 40分鐘 4) 用1x PBS洗滌→2x 10分鐘 5) 用0.2％Triton X-100 / PBS透化細胞→1x 20分鐘 6) 用1x PBS洗滌→6x 10分鐘 7) 用1% BSA/PBS阻斷非特異性抗原→過夜 8) 用1x PBS洗滌→6x 10分鐘 9) 添加一抗：單克隆抗VE鈣黏著蛋白，小鼠（在1％BSA / PBS中為1：100）→在4°C下1x 24小時 10) 用1x PBS洗滌→6x 10分鐘 11) 添加二抗：山羊抗小鼠IgG（H + L），Alexa Fluor 680（在1％BSA / PBS中為1:50）→在4°C過夜 12) 用1x PBS洗滌→6x 10分鐘 13) 加入染色混合物→1x 40分鐘 i) 羅丹明phalloidin染色肌動蛋白絲（PBS中1：400） ii) Hoechst 33342對細胞核染色（1：100，PBS中0.5 μg/ml） 14) 用1x PBS洗滌→6x 10分鐘 15) 將PBS留在儲液罐中并開始成像。 免疫熒光圖像是由共聚焦激光掃描顯微鏡獲得，配以水物鏡。 重要提示：與標準染色方案相比，洗滌和染色步驟所需的培養時間更長。這是為了確保抗體通過凝膠充分擴散。 實驗結果： HUVEC在Matrigel?基質中的免疫染色顯示，相鄰的細胞組優先形成細胞簇并作為集合體遷移。少數細胞呈單細胞遷移。  圖中顯示HUVEC在50%Matrigel?中的多細胞趨化性的細胞簇。固定后，對細胞進行細胞核（藍色）、F-肌動蛋白（紅色）和VE鈣粘蛋白（青色）染色。白色箭頭表示VE介導的細胞-細胞接觸。當以多細胞單元組織時，細胞團簇表現出明顯的前后不對稱的群分化。遷移復合體較深區域的連續細胞沒有分化。然而，這些細胞特征性地保留了VE鈣粘蛋白介導的細胞-細胞接觸。 |
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